背景：
由病原真菌引起的植物病害对全球粮食产业和水果工业造成了巨大的经济影响。施用
有机肥并辅以生防微生物（即生物
有机肥）已被证明能够提高植物对病原菌的抵抗能力，其中部分原因是生物有机肥影响土壤微生物群落结构和功能。然而，目前尚不清楚这些效应是由微生物菌剂的特殊作用、有机肥料中自然存在的微生物种群还是堆肥基质的物理化学性质所驱动的。本研究旨在探究生物有机肥抑制病害的生态机制。
结果：
为了弄清生物有机肥的作用机理，我们调查了三个生长季节中香蕉枯萎病的发病情况及对应的土壤微生物群落结构，并设置了以下4种处理：生物有机肥（含解芽孢杆菌W19）、有机肥、灭菌有机肥、辅以解淀粉芽孢杆菌W19的灭菌有机肥。我们发现，在整个种植季节，重新接种芽孢杆菌的灭菌生物有机肥与未灭菌的生物有机肥具有相似的抑病效果。我们进一步观察到，这些处理中的病害抑制与土壤微生物群落有关，特别是增加特定假单胞菌的情况下。在实验室盆栽试验中进一步研究了芽孢杆菌改良剂和本地假单胞菌之间的相关性，这可能是抑制病原菌的基础。这些研究表明，特定的细菌类群协同增加生物膜的形成，并可能作为一个植物有益的联合体对抗病原菌。
结论：
我们论证了生物有机肥的作用，主要由其中的生防菌剂对其土壤微生物群落造成影响来发挥作用。这个研究为未来有效利用生物肥料促进土壤菌群功能的设计提供了理论依据，
关键词：
生物有机肥、枯萎病、病害抑制、常驻微生物群、假单胞菌属、种间协同作用
1 材料和方法
1.1 材料和试验设置
试验地：海南省乐东县尖峰镇万中有限公司温室
供试样品：香蕉（连续种植3年）
供试土壤：连作香蕉10年以上且枯萎病发病率高的连作土
土壤处理：见下表
1.2 方法
a、土壤样品和DNA提取：根际土+ 非根际土，使用PowerSoil DNA分离试剂盒提取DNA
b、细菌和真菌群落测序（16SrRNA、 ITS）
c、生物信息学分析（生成分类单元（OTU）、方差分析）
d、实时定量PCR分析（qPCR）
e、可培养镰刀菌和芽孢杆菌的测定（10倍稀释平板法）
f、假单胞菌CFU定量（10倍稀释平板法）、菌株分离鉴定、镰刀菌抑制（双重培养法）、生物膜形成（改良结晶紫法）、芽孢杆菌吸引试验（V型培养）
g、假单胞菌对植物病害水平的影响
h、假单胞菌共培养对尖孢镰刀菌（FOC）密度的影响
2 结果与分析
2.1 香蕉枯萎病发病率：
在试验的所有三个季节中，生物肥处理（OF+W19和SOF+W19）（Duncan检验，P<0.05）都降低了香蕉枯萎病的发病率，与有机肥处理（SOF和OF）相比，OF+W19在每个季节的发病率最低（图1A）。SOF+W19组和SOF+W19组的发病率无显著性差异（Duncan检验，P>0.05），而OF+W19和SOF+W19处理间的发病率无显著性差异（P>0.05）。
图1：（A） 四种施肥处理对香蕉枯萎病发病率的影响。（B） 第二季根际土壤中尖孢镰刀菌的可培养丰度、总丰度和相对丰度。
2.2 微生物群落组成
从微生物群落组成的分析，A图中根际土壤和非根际土壤的细菌存在显著差异，B图中的真菌则没有差异。总的来说，根际土壤细菌的相似性是大于非根际土壤细菌的相似性的，而真菌群落对不同施肥制度没有表现出明显的一个变化模式。结构方程模型（通径分析）（图2C）表明，解释病害的最强驱动力是病原菌密度（r=0.459，p=0.003），其受根际细菌群落组成的负影响（r=-0.360，p=0.015）。非根际土壤细菌群落结构在很大程度上决定了根际细菌群落的组成（r=0.756，p=0.005）。
图2：细菌（A）和真菌（B）群落组成的非度量多维标度（NMDS）排序；（C）合并的结构方程模型
2.3 微生物响应类群
我们进一步研究了哪些细菌OTUs与特定施肥处理和香蕉枯萎病的程度相关。基于线性判别分析（LDA），233株根际细菌OTUs在不同施肥条件下存在差异。与有机肥处理相比，生物有机肥处理富集了43个OTU（丰度增加了2倍以上）。Spearman相关分析发现34个OTU与疾病发生率相关（FDR<0.05）（图3A）。在这些反应性微生物类群中，优势类群OTU7，被指定为假单胞菌属，显示出一个特别显著的模式，促使对这个OTU进行更详细的检查。在生物肥料处理中，假单胞菌OTU7的相对丰度最高，分别占OF+W19和SOF+W19细菌群落总数的4.94%和3.27%（图3B）。相比之下，在OF和SOF处理中，OTU仅占细菌总数的1.00%和1.25%（图3B）。此外，假单胞菌OTU7与枯萎病发病率呈负相关（P<0.001）（图3C）。
图3：（A）1） OTUs的门级分类；2）OTUs对四个处理有显著反应（LDA>2）；3）OTUs的倍数变化；4）OTU相对丰度与发病率的相关性；5） OTU相对丰度的变化规律。（B）不同处理间假单胞菌OTU7的相对丰度。（C）线性回归OTU7假单胞菌相对丰度与发病率的关系。群体间的线性回归关系土壤（D）和根际土壤（E）中芽孢杆菌和假单胞菌的总密度。
2.4 假单胞菌及其对镰刀菌的抑制、生物膜形成和芽孢杆菌吸引特性
从经生物有机肥和有机肥改良的根际土壤微生物群中随机分离鉴定出88株假单胞菌，根据16S rRNA基因序列，代表14个不同的系统发育群（图4A）。共有36株菌株对枯萎病病原菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.cubense，FOC）表现出拮抗作用，其中生物有机肥处理（OF+W19）的假单胞菌比例高于有机肥处理的菌株（t检验，P<0.01，图4B）。52%的根际土壤中的假单胞菌对溶淀粉双歧杆菌W19没有影响，而根际土壤中有74%的假单胞菌对W19有抑制作用（t检验，P<0.01，图4B）。
图4：（A）树枝图显示88株根际土壤假单胞菌与OTU7之间的系统发育关系。叶标签表示代表性序列ID。内环表示物种级别的分类学，外圈表示从中分离菌株的处理的土壤。（B）在我们的双重激发试验中，具有FOC抑制能力，具有解淀粉芽孢杆菌W19抑制能力的假单胞菌的百分比，与W19共培养生物膜试验中具有生物膜增强作用的假单胞菌的百分比
2.5 假单胞菌PSE78的抑病能力及其与溶淀粉双歧杆菌W19的相互作用
假单胞菌PSE78对枯萎病有较强的抑制作用（图5A）。与对照组和其他处理相比，PSE78处理组的发病率较低（Duncan检验，P<0.05），平均值为12%，而假单胞菌菌株PSE82与SOF处理比较，发病率无差异（Duncan检验，P>0.05）（图5A）。芽孢杆菌和假单胞菌数量呈正相关（P<0.001，图5B）。虽然这三种菌株单独使用时都在一定程度上降低了FOC密度，但当PSE 78和W19共同接种在试验土壤中时，FOC密度的降低幅度最大（图5C）。有趣的是，PSE82与W19的组合在抑制病原体方面的效果不如这些菌株单独使用（图5C）。
图5：（A）与灭菌有机肥（SOF）和化肥（CK）处理相比，接种PSE78和PSE82的灭菌有机肥处理土壤中香蕉枯萎病的发病率；（B）香蕉根际土壤芽孢杆菌和假单胞菌种群密度的线性回归分析，符号颜色与A图一致；（C）框线图中给出的处理名称相对应，显示在指定预处理基质上生长的植物根系上的FOC数量。
3 结论
作者在一个概念模型（图6）中总结了实验结果，该模型描述了施用生物有机肥抑制枯萎病的作用模式。
生物制剂B. amyloliquefaciens W19能够在根际环境中建立（A）直接抑制病原菌的生长；（B）引起微生物组尤其是细菌部分的变化，对病原菌密度产生负面影响；（C）共同激活根际微生物群落中存在的特定有益植物相关微生物，（D）可能导致激活与特定植物有益细菌属（如假单胞菌属）形成多物种生物膜，从而（E）直接或间接，限制真菌病原菌感染植物根部的能力。
图6：生物有机肥改良土壤中植物根际发生的事件顺序的概念模型
4 展望
作者展望：
未来的生物防治策略可能包括联合接种协同作用的细菌物种，以促进土壤的抗病性等特定功能；此外，潜在的生防菌株也可能更多的被筛选出来，不仅是因为它们能够拮抗特定病原体，而且能够刺激潜在的协同寄居群体。
译者期望：
本研究证实了
生物有机肥在有效抑制病害发生方面的潜在微生物生态学机制，为通过具体管理措施诱导土壤抑病能力提供了理论基础，为将来更有效地应用生防菌剂促进农业可持续发展开辟了新的机会，也为含有多功能生防菌群生物有机肥的研制，以及高效生防菌株筛选提供了借鉴意义。
标题：Bio-organic fertilizers stimulate indigenous soil Pseudomonas populations to enhance plant disease suppression 期刊：Microbiome IF： 11.6 发表时间：2020 年 5 月 通讯作者：沈其荣 教授 主要单位：南京农业大学 译者：张帅 云南农业大学 博士一年级
